单核细胞增生李斯特菌特异性单链抗体磁珠的制备与评价（一） 较难在培养后分离获得目标菌

单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）是单核食品中重要的致病性微生物，也是细胞性单李斯特菌属内能引起肠胃炎、败血病、增生珠的制备脑膜炎和李斯特菌病等最主要的李斯链抗病原体，致死率达30%，特菌特异体磁对免疫缺陷人群危害严重。单核该菌广泛存在于乳制品、细胞性单肉制品、增生珠的制备蔬菜水果和海产品等各类食品中，李斯链抗能在pH4.0、特菌特异体磁高盐和4℃环境中存活并繁殖。单核

单核细胞增生李斯特菌的细胞性单生长易被其同属内的其它细菌（如英诺克李斯特菌等）掩盖，较难在培养后分离获得目标菌，增生珠的制备导致假阴性检测结果。李斯链抗免疫磁珠捕获技术（Immuno-magneticbeadstechnology，特菌特异体磁IMBs）可在复杂体系中特异性地捕获目标微生物，获得活菌体。IMBs的特异性依赖于所用抗体的性能，而抗体受制于生产工艺，其质量与产量都不稳定。与传统免疫血清、杂交瘤等抗体制备技术相比，噬菌体展示技术（phagedisplaytechniques）通过噬菌体库与目标菌的特异性结合，筛选获得高特异性的表面单链抗体片段（single-chainantibodyfragments，scFvs）。将表达特性蛋白的基因转移至质粒内，可稳定保存并大规模生产具有相同特性的单链抗体。

前期有研究报道一种对单核细胞增生李斯特菌具有高特异性的噬菌体展示单链抗体片段的制备方法。本研究基于该片段的特异性，制备亲和素偶联的scFv免疫磁珠（scFv-IMBs）。通过在多种增菌培养体系中的定性、定量检测，考察scFv-IMBs对不同李斯特菌属细菌的特异性捕获情况，评价scFv-IMBs在人工污染的法兰克福香肠中分离单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌的能力。

1材料与方法

1.1菌株及培养条件

试验使用了14株单核细胞增生李斯特菌和9株其它李斯特菌属细菌（表1）。菌种复苏于脑心浸液（BHI）培养基（BDDiagnostics，Sparks，MD）中，置37℃振荡培养过夜，振荡速度为250r/min。选择RAPIDL.MonoAgar（Bio-Rad，CA）作为李斯特菌显色培养基，该培养基上单核细胞增生李斯特菌显蓝紫色，伊氏李斯特菌显蓝绿色，英诺克等其它李斯特菌显白色。市售李斯特菌免疫磁珠Dynabeadsanti-Listeria（Dyna-IMBs），购自ＴhermoScientific。
 

1.2抗体磁珠的制备

按已报道的方法采用含pBAD：A8质粒的大肠埃希菌（E.coliAＶB100）制备生物素标记的scFv抗体。以含0.3%的L-阿拉伯糖和1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPＴG）进行诱导培养，用弗氏细胞破碎仪获得裂解液，经离心、层析和过滤纯化得到含生物素标记的scFv清液。

取链霉亲和素标记的DynabeadsM280磁珠100μL（ＴhermoScientific），加入PBS缓冲液（20mmol/L磷酸盐，150mmol/LNaCl，pH7.4）900μL，混匀。置磁力架上振摇收集磁珠，弃去液体。将磁珠分散于含0.1%牛血清蛋白的PBS缓冲液（以下简称PBS缓冲液）中活化。取约10μg生物素标记的scFv抗体，加入活化的磁珠体系中（浓度约为7×109～9×109个/mL），室温振荡1h。在磁力架上稳定3min，用PBS缓冲液反复清洗4次，分散于1mLPBS缓冲液中，制备成scFv结合的免疫磁珠（scFv-IMBs），置4℃保存。

1.3细菌基因组DNA提取及PCR检测

DNA提取选用DNeasyBloodandＴissueKit试剂盒（QIAGEN，Maryland，US），按说明书操作。DNA溶解于100μLＴE缓冲液中，-20℃保存。

从5对备选李斯特菌特异性PCR引物（表2）中筛选单核细胞增生李斯特菌特异性扩增引物。

反应体系为：模板溶液1μL，DNA聚合酶1U（GoＴaqDNApolymerase，Promega，WI），1×PCR缓冲液，MgCl2浓度1.5mmol/L，dNＴP浓度各0.25mmol/L，上下游引物各50nmol/L，加纯水至25μL。用iQ5实时荧光定量系统（Bio-Rad，CA），反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火40s，72℃延伸40s，共30个循环；最后72℃延伸5min。以1.0%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物6μL，在150Ｖ电压的1×ＴAE缓冲液（Ｔrisacetate-EDＴAbuffer）中电泳20min，用10μg/mLEB染料（ethidiumbromide）染色15min后，置紫外凝胶成像仪（MultiImageLightCabinet，Alphalmager）观察。标准DNA分子质量采用ExactGene（lowRangeDNAladder，FisherBioReagents，NY），以单核细胞增生李斯特菌AＴCC19115基因组DNA为阳性对照，纯水为空白对照。

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